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Un bouquet d’enzymes pour transformer le saccharose en nouveaux biopolymères

Pour enrichir la palette de polymérases et enzymes de branchements dédiées à la production à façon de nouveaux glucopolymères, oligosaccharides ou glucoconjugués, un séquençage ciblé de génomes couplé à des analyses bioinformatiques a permis d’isoler quatre nouvelles enzymes utilisatrices de saccharose aux propriétés remarquables. Ainsi, une enzyme synthétisant un glucopolymère linéaire (dextrane) dont la taille peut être ajustée par la concentration de saccharose et deux enzymes capables d’introduire des branchements liés à la demande, ont été découvertes. Parallèlement, une hyper-polymérase a été repérée dans un génome d’Oenococcus sp., qui produit un dextrane présentant une viscosité surpassant par plusieurs ordres de magnitude la viscosité des dextranes commerciaux. La voie est ouverte pour un vaste champ de nouvelles applications.

CONTEXTE DE LA REALISATION

La demande en polysaccharides d’origine naturelle, extraits de plantes ou d’algues, produits par des champignons ou des bactéries - pour la plupart biodégradables, et produits par des procédés propres- ne cesse de croître. Leur formidable diversité structurale ajoute à ces mérites un large spectre de propriétés biologiques et physico-chimiques d’intérêt pour des applications en industrie agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique et chimie fine. Les polysaccharides d’origine microbienne, pour lesquels la production est maitrisée et indépendante des aléas climatiques ou géopolitiques, suscite un intérêt croissant. C’est en particulier le cas des polymères produits par une classe d’enzymes bactériennes : les a-transglucosylases de la famille 70 des Glycoside-Hydrolases qui synthétisent à partir de saccharose la synthèse d’homopolymères de glucose généralement de haute masse molaire (105 - 108 g.mol-1) ainsi que la synthèse d’oligosaccharides et de glucoconjugués en présence d’accepteurs. Dans ce contexte, l’accès à de nouvelles transglucosylases devrait permettre de diversifier et mieux contrôler les structures polymériques potentiellement accessibles à partir de saccharose. Ces travaux sont par ailleurs fortement stimulés  par la récente décision de l'Union Européenne de libéraliser le marché du sucre en Europe fin 2017.


Un bouquet de nouvelles enzymes pour la biotransformation à façon du saccharose en nouveaux glucanes

 

RÉSULTATS

Une approche de génomique fonctionnelle a été appliquée à la recherche de gènes codant pour de nouvelles enzymes GH70 dans les génomes de Leuconostoc citreum NRRL B-1299 et NRRL B-742, deux souches de bactéries lactiques identifiées dès 1954 comme productrices de dextranes très ramifiés (taux de branchements supérieurs à 25%) et dont le mode de synthèse n’avait pas été élucidé jusqu’alors. Le séquençage et l’analyse de ces génomes ont mis en évidence trois gènes remarquables, les gènes dsrM et brsA dans la souche NRRL B-12996, et le gène brsB dans la souche NRRL B-7425. Les enzymes ont été produites sous forme recombinante et caractérisées. Tout d’abord, l’enzyme DSR-M s’est avérée être une polymérase dédiée à la synthèse d’un dextrane de faible masse molaire, a contrario de toutes les autres polymérases de la famille GH70 caractérisées jusqu’à présent. En outre, nous avons montré que la taille du polymère pouvait varier entre 7.103 et 27. 103 g/mol en fonction de la concentration initiale de saccharose utilisée1. Les deux autres enzymes, BRS-A et BRS-B sont quant à elle des enzymes spécifiiques du branchement des dextranes linéaires, par transfert d’unités glucosyle sur la chaîne linéaire d’un dextrane accepteur,  soit par l’introduction de liaisons a-1,2 pour la première, et de liaisons a-1,3 pour la seconde. Ces découvertes ont permis d’élucider le mécanisme de formation des dextranes hautement ramifiés impliquant l’intervention de deux enzymes (une polymérase et une enzyme de branchement) et de proposer des voies de production permettant de contrôler, dans les polymères formés, à la fois la taille et le degré de branchement1,2,7 . En parallèle, un gène original a également été identifié dans le génome d’Oenococcus kitaharae. L’enzyme recombinante, DSR-OK, est la première glucane-saccharase caractérisée provenant de ce genre bactérien. Elle catalyse la formation d'un polymère incroyablement grand en taille et 1000 fois plus visqueux que les dextranes commerciaux3. Enfin, ces nouveaux catalyseurs ont également révélé des propriétés uniques pour la production de gluco-flavonoides solubles4.

 

PERSPECTIVES

Ces avancées permettent aujourd’hui de disposer de nouveaux outils pour continuer d’investiguer, sur un plan fondamental, les relations structure-spécificité des enzymes de la famille GH70. Les spécificités singulières des enzymes découvertes ont stimulé les recherches pour l’obtention des structures tri-dimensionnelles de DSR-M et DSR-OK (thèse en cours). Elles ouvrent aussi la voie à l’investigation des relations structure-propriétés des différents polymères de glucose obtenus avec ces enzymes et pouvant présenter un contrôle fin, à la fois de la taille ainsi que de la nature et du taux de branchements (projet ANR ASPIRE). Des voies de production enzymatique de polymères, d’oligosaccharides prébiotiques résistants à l’action des enzymes digestives et de glycoflavonoïdes sont explorées en partenariat direct avec l’industrie (3 contrats LISBP-TWB).

 

PARTENAIRES

UR 1268 BIA Biopolymères Interactions Assemblages (Nantes)

Institut de la science de la vigne et du vin (Bordeaux)

Financement ANR Oenopolys ; ANR ENGELS, Projet pré-compétitif LISBP-TWB Glycoflav.

 

VALORISATION

  1. Vuillemin, M., Claverie, M., Severac, E., Fauche-Fontagné, C., Monsan, P., Remaud-Simeon, M., Moulis C. Protein with dextran activity, and uses. Brevet n°: WO2016016544 (A1)
  2. Vuillemin, M., Morel, S., Monsan, P., Moulis, C., Remaud-Simeon, M. Polypeptide having the ability to form connections of glucosyl units in a-1,3 on an acceptor. Brevet n° WO2014202208 (A1) 
  3. Vuillemin, M., Claverie, M., Grimaud, F., Sabate, A., Garnier,  C., Dols-Lafargue, M., Lucas, P., Monsan, P., Remaud-Simeon, M., Moulis C. Very High molar mass dextrans. Brevet n°: WO2015193492 (A1)
  4. Morel, S., André, I., Brison, Y., Cambon, E., Malbert, Y., Pompon, D, Urban, P. Remaud-Simeon, M. Novel flavonoids O-a-glucosylated on the B cycle: method for the production thereof and uses. Brevet n°: WO2015144731 (A1)

 

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES EN LIEN DIRECT AVEC LES REALISATIONS

  1. Vuillemin, M., Claverie, M., Brison, Y., Séverac, E., Bondy, P., Morel, S., Monsan, P., Moulis, C., Remaud-Siméon, M., 2016. Characterization of the First α-(1→3) Branching Sucrases of the GH70 Family. 2016. J. Biol. Chem. 291(14), 7687–7702.
  2. Passerini, D., Vuillemin, M.,  Ufarté, L., Morel, S., Loux, V., Fontagné-Faucher, C.,  Monsan, P., Remaud-Siméon, M., Moulis, C.  Inventory of the GH70 enzymes encoded by Leuconostoc citreum NRRL B-1299 - identification of three novel α-transglucosylases. 2015. FEBS J., 282, 2115–2130
  3. Moulis C., André I., Remaud-Siméon M. 2016. GH13 amylosucrases and GH70 branching sucrases, atypical enzymes in their respective families. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-19

Contact : Claire Moulis, claire.moulis@insa-toulouse.fr (claire.moulis @ insa-toulouse.fr);  Magali Remaud-Simeon, remaud@insa-toulouse.fr (remaud @ insa-toulouse.fr)