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RMN et acides aminés : du très petit au très grand

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique analytique qui permet d’observer des molécules de toute taille. Nous avons montré qu’elle peut suivre l’incorporation d’isotopes stables et ainsi donner des renseignements sur le métabolisme des (micro-)organismes. La catalyse par les nanoparticules de Ruthénium a permis  l’incorporation d’autres isotopes stables, et permet ainsi l’étude structurale et dynamique des macromolécules comme les enzymes.

La RMN permet d’observer la structure des macromolécules, leur dynamique et leurs interactions moléculaires. L’incorporation du 15N, l’isotope stable de l’azote, est essentiel pour l’étude des protéines. L’expérience de base caractérise une protéine par un spectre à deux dimensions où une tache corrèle les deux fréquences proton et azote de la fonction amide de chaque acide aminé. En même temps, la technique de RMN a été utilisée pour l’étude des voies métaboliques, notamment en suivant l’incorporation de l’isotope de 13C.  En s’appuyant sur la méthodologie développée pour l’étude des protéines, nous avons introduit la RMN du 15N pour suivre le métabolisme d’une bactérie d’une façon rapide et détaillée (1). La limite de la taille des macromolécules accessibles à une analyse par RMN peut être repoussée en diminuant la densité de protons. Deutérer les acides aminés en surexprimant une protéine dans le D2O est une façon populaire, mais elle ne permet pas l’incorporation d’acides aminés sélectivement marqués. En s’appuyant sur la deutération post hoc par nanoparticules de Ruthénium, développée au LPNCO de l’INSA, nous avons obtenu des acides aminés avec une deutération spécifique (2).

 

La capacité de deutérer sélectivement des acides aminés ouvre la voie d’étudier en détail l’effet de mutations ponctuelles sur la dynamique et la fonction catalytique des enzymes de grande taille. Des mutants de la dextran sucrase DSR-M, étudié par l’équipe de Magali Remaud (3), sont actuellement étudiés par cette approche.

 

Partenaires :

EAD6 – Metatoul pour l’analyse du métabolisme par RMN

EAD11 - pour le marquage des acides aminés en 15N

LPNCO (B Chaudret) pour la deutération des acides aminés

EAD1 - pour l’étude des enzymes

 

 

Références : 

1.         Millard, P., Cahoreau, E., Heuillet, M., Portais, J.-C., and Lippens, G. (2017) (15)N-NMR-Based Approach for Amino Acids-Based (13)C-Metabolic Flux Analysis of Metabolism. Anal. Chem. 89, 2101–2106

2.         Martínez-Prieto, L. M., Baquero, E. A., Pieters, G., Flores, J. C., de Jesús, E., Nayral, C., Delpech, F., van Leeuwen, P. W. N. M., Lippens, G., and Chaudret, B. (2017) Monitoring of nanoparticle reactivity in solution: interaction of l-lysine and Ru nanoparticles probed by chemical shift perturbation parallels regioselective H/D exchange. Chem. Commun. Camb. Engl. 53, 5850–5853

3.         Claverie, M., Cioci, G., Vuillemin, M., Monties, N., Roblin, P., Lippens, G., Remaud-Siméon, M., and Moulis, C. (2017) Investigations on the determinants responsible for low molar mass dextran formation by DSR-M dextransucrase. ACS Catal. 10.1021/acscatal.7b02182

 

Contact : 

Guy LIPPENS  - glippens@insa-toulouse.fr